饲料中霉菌毒素生物学特性及其检测防治的研究进展

饲料中霉菌毒素生物学特性及其检测防治的研究进展

朱润芝^1,5 赖林泉¹ 李京敬¹ 张海彬² Charles Han³ Andrew H, Davis⁴ 俞雁^1*

¹上海交通大学农业与生物学院兽医生物技术上海市重点实验室，上海200240

²南京农业大学动物医学院，南京200095

³Research Institute of Interface Protein，Naperville，IL 60563 USA

⁴Rembrandt Enterprises Inc，Rembrandt， IA 50576 USA

⁵南京美卡贸易有限公司，南京210012

摘要：霉菌毒素是毒性很强的霉菌次生代谢产物，农作物的霉变是重要诱因。当被动物体食入、吸入或被皮肤吸收后，霉菌毒素常常会引起机能减退、疾病乃至死亡。导致饲料霉菌毒素污染的原因包括环境因素和饲料生产环节两个方面。高温高湿的环境会促进霉菌毒素的生长旺盛。近十年来霉菌毒素的研究因为与人类以及动物的健康和生产密切相关而不断得到重视。因此，饲料原料有效的、低成本的、快速的检测手段尤为重要。当前方法有使用高效液相色谱（HPLC），薄层色谱法（TLC）。此外，酶联免疫吸附（ELISA）也被应用到快速检测中。荧光偏振免疫法等新方法也逐步被应用，基于红外光谱技术的方法也不断被报导。防治农作物霉变的方法包括提早收割，合理干燥、设备处理和储存加工。此外可以使用化学、生物、脱霉剂等来减少霉菌毒素的危害。

关键词：饲料；霉菌毒素；霉菌毒素检测；污染；防治

Study on mycotoxins in Feed: Biological character, methods of analysis and control.

Zhu Runzhi^1,5 Lai linquan¹ Li Jingjing¹ Zhang Haibin² Charles Han³ Andrew H,Davis⁴ Yu Yan^1*

¹Shanghai Municipality Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200240

²College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural university，Nanjing200095

³Research Institute of Interface Protein，Naperville，IL 60563 USA

⁴Rembrandt Enterprises Inc，Rembrandt， IA 50576 USA

⁵Nanjing Meica Trading Corporation, Nanjing210012

Abstract: Mycotoxins are toxic secondary metabolites of fungal origin and contaminate agricultural commodities. When ingested, inhaled or absorbed through the skin, mycotoxins will cause lowered performance, sickness or death on animals. Factors that contribute to mycotoxin contamination of feed include environmental and feed production. Environmental conditions especially high humidity and temperatures favour fungal proliferation resulting in contamination of feed. Mycotoxin concerns have grown during the last few decades because of their implications to human and animal health, productivity. There is need for efficient, cost-effective sampling and rapid analytical methods that can be used for detection analysis of mycotoxins in feed. Current quantitative methods of analysis for most mycotoxins use high-performance liquid chromatography (HPLC). Screening of samples contaminated with mycotoxins is frequently performed by thin layer chromatography (TLC). Nowadays, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are often used for rapid screening. A number of promising methods, such as fluorescence polarization immunoassaysand even newer methods based on infrared spectroscopy, have shown great potential for mycotoxin analysis. Possible intervention strategies include good agricultural practices such as early harvesting, proper drying, sanitation, proper storage and insect management among others. Other possible interventions include biological control, chemical control, decontamination, breeding for resistance as well as surveillance and awareness creation.

Key words: feed；mycotoxin；mycotoxin analysis；contamination；control

霉菌毒素研究相继开展了霉菌毒素的分子结构测定、霉菌毒素的产生条件、霉菌毒素的毒理学、霉菌毒素降解等方面的研究。霉菌毒素的结构、化学、生物和毒理性是多种多样的，不同情况下毒性也不同，这些影响因素包括摄入量、摄入时间长短、动物种类、性别、年龄、品系、生理状态、营养状况、环境条件（包括卫生状况、温度、空气状况、湿度、生产密度）以及最终同时存在于饲料和食品中的霉菌毒素之间的协同作用。尽管存在着诸多变异，霉菌毒素得毒性效果仍主要表现为致癌性、遗传毒性、致畸性，还会引起肾中毒、肝中毒、生殖异常以及抑制免疫反应。因此，消除霉菌毒素，对保证动物健康，充分发挥动物的生产潜能有重大意义^[1-4]。

1霉菌毒素的生物学特性及其危害

1.1 霉菌毒素的生物学特性

霉菌毒素是毒性很强的霉菌次生代谢产物，这些霉菌主要属于镰刀菌属，青霉菌属以及链格孢属（Fusarium，Aspergillus，Penicillium及Alternaria species）。据估计，至少有300种这类真菌代谢物对人类和动物具有潜在毒性，但是为大众熟知并被广泛研究的只有黄曲霉毒素B1（AFB1），玉米赤霉烯酮（ZON），呕吐毒素(DON)，T-2毒素，赭曲霉毒素(OTA)以及烟曲霉毒素(FUM)^[5]。全球范围内动物饲料、饲料原料和人类食品中都广泛存在霉菌毒素，根据世界粮农组织的调查，世界上每年有25%的粮食受到已确认的霉菌毒素的污染。这些霉菌毒素可以通过被污染的谷物、饲料和由这些饲料喂养的动物所提供的动物性食品（奶、肉、蛋）进入我们的食物链。

纯品霉菌毒素研究的实验室条件非常苛刻，需要类似进行SARS病毒操作的负压环境和生物安全三级的实验室，否则会危害研究者的健康。在实验条件达不到要求时，对霉菌毒素进行研究，无异于冒险闯雷区。

1.2 饲料中常见的霉菌毒素种类及对畜禽的危害

研究表明饲料中黄曲霉毒素浓度高低与动物疫情流行有着密切关系，美国上世纪80年代在霉菌毒素爆发导致随后猪大肠杆菌病流行；2003～2004年，亚洲各国动物疫情大规模爆发，与天气异常导致谷物大量霉变有直接关系。据姚龙涛等报道，2006年江西“高热病”发病猪群所饲喂饲料几乎全部存在霉菌毒素含量超标或严重超标，更换合格饲料后，疫情控制的很快，紧急接种疫苗效果好。

美国霉菌毒素委员会的研究成果显示，霉菌毒素的核心危害作用是对免疫系统的破坏及对免疫应答的强烈抑制，从而将动物预置于被感染的环境之中，导致对疾病的易感性增强，抗病力下降，这是目前中国养猪生产普遍存在而被忽略的领域。对免疫系统功能抑制作用最强的是黄曲霉毒素；对凝血系统破坏作用最强的也是黄曲霉毒素。饲料原料和配合饲料中几种霉菌毒素同时存在是常见的现象。霉菌毒素间的协同作用对动物健康和生产性能的作用比任何一种霉菌毒素单独作用的危害都要大^[6]。霉菌毒素间的相互作用具有可加性和协同效应。如萎焉酸本身对动物毒性不大，但是当它和呕吐毒素同时存在时，毒性就会增强。

1.3 饲料及原料受霉菌毒素污染的现状

根据我国有关规定，以下各种霉菌毒素的允许最高限量如下表：

中国配合饲料中霉菌毒素最高限量

种类

黄曲霉毒素

烟曲霉毒素

赭曲霉毒素

T-2 毒素

呕吐毒素

玉米赤霉烯酮

限量

（µg/kg）

20

50

20

80

500

100

国家卫生标准霉菌毒素限量标准目录（2005）

张子仪院士(2000)分别从华南、华北、华中的饲料厂、原料仓库采集了109个样品，使用酶联免疫法测定了各样品中的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的含量。结果显示为：玉米中6种霉菌毒素污染均比较普遍，其中呕吐毒素、烟曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的污染严重；配合料中6种毒素检出率均在90%以上，其中烟曲霉毒素和呕吐毒素污染严重；蛋白质饲料（豆粕、鱼粉）中黄曲霉毒素检出率100%，其中，T-2 毒素97.8%，玉米赤霉烯酮92.9%，呕吐毒素87.0%，赭曲霉毒素41.3%，烟曲霉毒素72.7%，而且6种毒素均有不同程度超标。

饲料原料中的霉菌毒素种类和含量也会随着天气状况而不断改变的。在常用的饲料原料中，玉米、麦类、稻谷等谷实饲料原料收获后如不能及时晒干，水分含量为17%～18%时，是霉菌生长繁殖旺盛^[8]。自然界中黄曲霉的环境耐受强，有氧条件下，花生和玉米是最好的繁殖场所，温度25～35℃，水分12%～18%，相对湿度80%～100%时容易产生黄曲霉毒素^[7]。

2 饲料中霉菌毒素的检测及防治

2.1 霉菌毒素的检测方法

2.1.1目测法

当畜禽出现拒食，饲料和谷物发热，有轻度异味，色泽变暗，饲料结块等迹象时应考虑饲料可能霉变。霉菌都是从霉菌孢子或菌丝体碎片开始生长的，霉菌生长时消耗了养分，代谢中有能量释放，故使饲料变色、变味、发热。菌丝体可与饲料纵横交织，形成菌丝蛛网状物，这些结构使饲料结块，饲料、饲料原料结块是饲料霉变的显著特征。

2.1.2霉菌菌落检测

不同的霉菌菌落各有其特征，通过显微镜观察可进一步检测确认。

曲霉属的菌落颜色多样，表面一般呈绒毛状，起初为白色或灰白色，长出孢子后则显现出不同的颜色，随菌种而异；青霉属的菌落大多呈灰绿色。菌落有绒状、絮状、绳状和束状4种类型。有的青霉菌菌落具有放射性皱褶，有的形成同心轮纹，有的在基质表面有渗出液。显微镜下观察时可见到独特的帚状体结构；镰刀菌属的菌落一般呈白色绒毛状，常产生可溶性色素。分生孢子有大小2种类型，显微镜下大型分生孢子大多呈镰刀形，多隔；小型分生孢子有卵形、梨形、圆形和柱形等^[15]。

2.1.3薄层层析法（TLC）

TLC法是我国测定食品及饲料中霉菌毒素的国家标准方法之一，其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来，经柱层析净化,再在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量^[9]。TLC 法由于设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用，但该法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，在展开时影响斑点的荧光强度，而双向展开虽避免了杂质干扰，但增加了操作步骤和时间^[16]。

2.1.4液相色谱法（HPLC）

HPLC法是近几年发展起来的检测霉菌毒素的方法，主要是用荧光检测器检测^[10]，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱，使霉菌毒素同时分离。该法快速而准确，但需要昂贵的仪器设备，未能广泛使用。用HPLC法检测，方法简便，纯化效果好，最低检出量0.08ng，回收率为92.87%，该法制柱方便，成本相对较低。

2.1.5酶联免疫法（ELISA）

ELISA由于快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测。该方法在检测霉菌毒素时灵敏度与TLC或HPLC 法相当或更高，具有广阔的应用前景^[11]。

2.1.6抑菌试验

主要用于黄曲霉毒素B1的快速检测。基本原理是利用一系列不同含量的标准黄曲霉毒素B1进行抑菌试验，测得各不同含量抑菌圈的大小，与标准曲线进行比较，计算出样品的含量（张华，2004）。

2.1.7其他检测手段

气相色谱法(Gas chromatography GC)近年来也被应用到高风险的饲料霉变污染的检测中，但是它不及液相色谱法价廉、快速^[12]；毛细电泳检测法（Capillary electrophoresis）也有相关报道，结合荧光检测非常准确有效，被应用到黄曲霉毒素和Fumonisins毒素检测中。当然，平时我们更多依靠多种检测手段共同验证，以达到准确、高效。

2.2 霉菌毒素的防治

2.2.1霉菌毒素的防控（防霉）

环境潮湿是霉菌繁殖最主要因素。霉菌的生长除了要求基质（粮食、饲料）有一定的营养、水分、PH等条件外，还需要适宜的温度、湿度和氧气。因此如能及时有效地控制这些条件，就能达到预防减少霉菌的滋生和毒素的产生^[13]。

2.2.1.1控制饲料原料的水分含量

收获后必须迅速干燥，把水分控制在一定范围内，一般玉米、高梁、谷物等饲料水分宜控制在14％以下，大豆、豆饼、豆粕、麦类、次粉、糠麸类饲料水分宜控制在13％以下，菜籽饼粕、棉籽饼粕、花生饼粕、鱼粉、肉粉及肉骨粉含水量宜控制在12％以下。

2.2.1.2 控制饲料加工过程中的水分和温度

饲料加工后如果散热不充分就装袋、贮存，会因温差导致水分凝结，极易引起饲料霉变。特别是在生产颗粒饲料时，要注意保证蒸汽的质量，调整好冷却时间与所需空气量，使出机颗粒的含水量和温度达到规定的要求。一般含水量在12.5％以下，温度一般可比室温高3～5％。

2.2.1.3 注意饲料产品的包装、贮存与运输

饲料产品包装袋要求密封性能好，如有破损应停止使用。应保证有良好的贮存条件，仓库要通风、阴凉、干燥，饲料四周要留有空隙，保持空气流通，相对湿度不超过70％。贮存过程中还应防止虫害、鼠咬。运输饲料产品应防止途中受到雨淋。

2.2.1.4 添加饲料防霉剂

经过加工的饲料原料与配合饲料极易发霉，故在加工时可应用防霉剂。常用防霉剂主要有有机酸类或其盐类，如丙酸、山梨酸、苯甲酸、乙酸及它们的盐类。其中丙酸、丙酸钠和丙酸钙应用最广。目前多采用复合酸抑制霉菌的方法（马玉翔等，2003；汪莉，2003）^[18]。

2.2.2饲料霉菌毒素的脱毒

对于霉变饲料要进行去毒处理与合理应用。霉菌毒素的脱毒是指通过物理、化学、微生物学的方法，使饲料中的霉菌毒素得到不同程度的失活或去除。

2.2.2.1 物理脱毒法

物理脱毒法主要有水洗法、剔除法、脱胚去毒法、加热和辐射法等。水洗法的脱毒效果因霉菌毒素的种类而异，如对于易于溶于水的串珠镰刀菌素、丁烯酸内酯、展青霉素等去毒效果好。而对难溶于水的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等去毒效果差。紫外线不仅可以杀死某些霉菌的菌体，而且可使某些霉菌毒素分解破坏。通常可用高压汞灯紫外线大剂量照射处理发霉饲料，也可以用日光晾晒法处理发霉饲料。据报道，将受黄曲霉毒素污染的饲料经阳光照射，可收到脱毒效果^[17]。

2.2.2.2 化学脱毒法

化学脱毒法主要是采用碱或氧化剂进行脱毒处理，如采用氨、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钙等进行脱毒处理，采用过氧化氢、次氯酸钠、氯气等氧化剂处理可使霉菌毒素降解失活。但对于大批量的饲料及原料采用上述物理、化学脱毒方法是没法进行的，且经化学脱毒处理往往会降低饲料的营养品质和适口性^[14]。

2.2.2.3 微生物及酶解法脱毒

微生物脱毒法是筛选某些微生物，利用其生物转化作用，使霉菌毒素破坏或转变为低毒物质的方法。据报道，用无根根霉、米根霉、橙色黄杆菌等进行发酵处理，对去除粮食和饲料中黄曲霉毒素有较好效果。在含有黄曲霉毒素的肉鸡日粮中添加啤酒酵母可降低黄曲霉毒素对肉鸡的危害。体外试验结果表明，添加一定量的酵母培养物可使88％的黄曲霉毒素被降解（Devegowda，1994）；酶解法主要是选用某些酶，利用其降解霉菌毒素，破坏或降低毒性。很多研究表明，酵母的细胞壁提取出葡甘露糖可以结合饲料谷物中大部分的黄曲霉毒素及玉米赤霉烯酮。研究（Devegowda，2000）发现，葡甘露糖具有降低多种霉菌毒素相互协同作用^[20]。

2.2.2.4 添加霉菌毒素吸附剂

吸附剂的吸附原理是使霉菌毒素在动物胃肠道内被紧密结合，使其不迁移，从而使霉菌毒素的生物转化率降到最低。矿物吸附剂如活性炭、澎润土、沸石、硅酸盐及铝硅酸盐等，具有很强的吸附作用，添加到饲料产品后，可以吸附饲料中的霉菌毒素，减少动物消化道对霉菌毒素的吸收。吸附剂对霉菌毒素的吸附效果与其分子结构的吸附能力以及霉菌毒素的特性有关。理想的霉菌毒素吸附剂应具有：能广谱吸附多种霉菌毒素，在饲料中使用量低，且有效；能在饲料中迅速均匀地混合；在制备颗粒、膨化料和饲料储存期间具有较强的稳定性；尽可能少吸附饲料中的维生素、微量元素或其他营养物质；具有高稳定性，排出后可被生物降解（Declan O，Sullivan, 2003）^[21]。

2.2.2.5 添加蛋氨酸、硒及植物源性黄酮

添加蛋氨酸可以减轻霉菌毒素特别是黄曲霉毒素对动物的有害作用。在饲料中添加硒也同样具有保护肝细胞不受损害和保护肝脏的生物转化功能的作用，从而减轻黄曲霉毒素的危害。欧洲在人类保肝药物中添加水飞蓟黄酮提取物已经有几百年的历史，有研究者把类似提取物添加在饲料中，效果明显^{[19, 22]}。

世界卫生组织长期以来一直倡导解决饲料中霉菌毒素的污染问题，在全球范围内加强对原料的监督是势在必行的。植物源性和动物源性的饲料原料要保证采购、生产、存储、运输过程中的绝对安全，科研工作者要及时为饲料工业提供最新相关资讯和研究进展，以加强人们对霉菌毒素的认知。

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