亚硝酸盐的测定方法有多种,如紫外可见分光光度法(比色法)、催化发光光度法(镉还原 分光光度法)、示波极谱法、气相色语法和高效液相色谱(HPLC)法等，国际方法为Griess试剂 比色法(N-l-萘基乙二胺比色法)，此方法(1992年颁布实施)基本是食品中 GB5009.33-85(1985)方法的翻版，而现行食品中亚硝酸盐测定方法己被改进后的1996年饭代 替，两法在明显差异(表1)。为了对饲料原料及各类饲料产品中亚硝酸盐含量实施有效的监督 ，针对现行国标方法中存在的问题，提出我们的看法和建议。
表1两种国标方法比较
GB5009.33-85和GB 13085-91 GB5009.33-1996
沉淀剂
饱和四硼酸钠溶液氯化铵缓冲液(pH9.6～9.7)
亚铁氰化钾溶液(10.6%)硫酸锌溶液(120g/L)
乙酸锌溶液(22%)氢氧化钠(20g/L)
显色剂
对氨基苯磺酸(0.4%和0.5%)对氨基苯磺酸(1%)
盐酸萘乙二胺溶液(0.2%和1%)N-1-萘基乙二胺溶液(0.1%)
盐酸(5mol/L)乙酸(60%)
比色
分光光度法(538nm)分光光度法(550nm)
1饲料样品的处理
国际法适用于饲料原料(鱼粉)和配、混合饲料的测定。但是在饲料样品的处理上，因具体的样品而不同。试样必须在除去蛋白质、脂肪和其他干扰物之后方可以显色定量。国际法规定 过于笼统。因此建议:
1.1样品采集
要求采样具有代表性，至少2kg，四分法缩至250g,粉碎后边40目筛，混合均匀。如果不能及时测定，必须密闭、避光和低温保存，以免硝酸盐和亚硝酸盐发生氧化还原反应，保持样品的完整性和重现性。
1.2试样制备 要求尽量在避光下迅速操作。不同饲料样品可采取不同的预处理方法:
1)油脂含量高的样品(如肉骨粉、鱼粉)需除去脂肪。可通过加热后冷却，使脂肪凝固滤去，或者用撇去法分开萃取上层脂肪。亦可以用强碱处理，使脂肪水解而除去。
2)对有色样品，特别是动物性下脚料或食品加工的废弃物，由于其色素可能残留至滤液中，因此沉淀蛋白质之后还应加入A1(0H)3乳液，然后再过滤，保证滤液无色透明。
3)瓜果、菜蔬类和青绿饲料，其中亚硝酸盐含量往往较高，目前国际中尚无该项专一的检测方法。由于这些样品蛋白质含量很少，因此可以不加蛋白质沉淀剂。根据不同的亚硝酸盐含量取样，瓜果类约15g，叶菜约5g,匀浆后定容，必要时加入果蔬提取剂(氯化镉和氯化钡的酸性混合溶液)。滤液中的色素应用A1(0H)3乳液或活性碳脱色。
4)对于乳制品或大豆制品，用乙酸锌和亚铁氰乙钾处理样液难以使溶液澄清，改用ZnS04和NaOH形成Zn(OH)3沉淀效果较好，但应控制用量。
5)各种干扰物质存在的处理。当反应液中NaCl达1%时，生成的偶氮化合物即出现褪色及沉淀，此时可在样品中加入HCl酸化后蒸馏，馏出液再被显色剂吸收。另外一些氧化物和还原剂也会产生干扰作用，如维生素C。当维生素C含量为1.0mg时，亚硝酸盐的回收率仅为25%左右。此时可以加入粉末状活性碳，以消除其干扰。
２试剂配制和仪器使用
2.1各种试剂参照国际配制，纯度为分析纯(A．R.)，其中亚硝酸钠要为优级纯(G.R.)，使用的水应为重蒸水。
显色剂:对氨基苯磺酸溶液和N-l-萘基乙二胺溶液配制时最好用酸性溶液(盐酸或乙酸溶液)以保证其稳定性。配好后立即装于棕色试剂瓶低温密闭保存。每次根据需要适量配制(使用时间不超过两周)。临用前将两者等体积混合，这样显色更加充分。
亚硝酸钠标准液:亚硝酸钠吸湿性强，在空气中易被氧化成硝酸钠，因此亚硝酸钠应在硅胶干燥器中干燥24h或经115±5℃真空干燥至恒重。标准液配制过程中适当加入NH4Cl缓冲液保持弱碱性环境(以免形成亚硝酸挥发)。配好的标准液放置于4℃冰箱密闭保存。
2.2仪器按照要求和操作规程使用。各种玻璃容器要经过严格洗涤干净，并用重蒸水润洗，烘干或晾干后备用。 容量瓶或比色管(带塞)应用棕色的。若用无色瓶，要遮光迅速操作。处 理样品时切勿用容量瓶加热，以免影响定容的准确性。
滤纸应用快速定量滤纸。过滤时弃去最初几滴，以免稀释或浓缩试液。
3检测条件的选择
3.1加热时间的确定
加热是为了进一步除去脂肪、沉淀蛋白质。若加热时间过短，蛋白质沉淀剂不能充分与样品反应，过长又易使亚硝酸盐分解生成氧化氮和硝酸，使测得结果偏低。国际91版为15min,96版为lOmin。刘虹涛(1998)报道不沸腾加热为3min。
3.2显色条件的选择
3.2.1酸度的选择 亚硝酸根离子在酸性条件下使对氨基苯磺酸重氨化，再与N-1-萘基乙二胺结合，呈现红色偶氨物。刘虹涛等(1998)在pH分别为0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.7条件下探讨，得出pH在2.5左右吸光度最佳;而宛枫(1999)认为pH在工5.5～6.9之间吸光度比较稳 定。
3.2.2显色反应方法比较
据于村(1999)报道，同一样品处埋液，用不同显色反应方法进行比色，结果以96版为高;不同样品处理液，用同种显色反应方法进行比色，结果85版明显较高。看来两者差异主要是样品 的前处理不同。于村认为96版使用的沉淀剂掩蔽性更好。
3.2.3显色时间的确定 宛枫(1999)探讨了显色时间对吸光度的影响，认为有色溶液的吸光值在卜"12Omin基本稳定，为提高分析速度取15min即可。也有人认为显色时间在8～2Omin较好 。但由于重氮偶合反应不稳定，显色后颜色不断加深，建议控制在15～16min比色较好。
4两种方法(85版和96版)精密度、准确度和灵敏度比较
刘虹涛(1998)进行了高、中、低3种浓度的加标试验，每一浓度重复6次。结果表明，添加高、中、低浓度亚硝酸钠标准溶液，加标回收率为99.2%～101.7%，并且3种浓度的精密度 均较好片日对标准偏差小于5.0%(96版法)。于村(1999)测得两者的回收率分别为94.3%(85版) 和98.5%(96版)，而且比较试验结果存在明显差异(P＜0.05)。至于比色时所选的人射光波长不同(分别为538nm和550nm)，经交叉试验表明两者没有显著差异(P＞0.05)。
总之，重氨化偶合反应测定亚硝酸盐已成为饲料、食品以及环境中监测的国家标准方法，该方法灵敏、简便快速而被广泛应用。但所用显色剂(α-萘胺或盐酸乙二胺)有致癌作用，因此长期操作还应注意防护。已有报道改用1,8-氨基萘酚-3,6二磺酸(简称H酸)代替显色，结果同样令人满意。
随着饲料各项卫生标准的逐一修订，测定方法的修订也迫在眉睫。目前有关饲料中亚硝酸盐测定方法的探讨甚少，能否借助其它行业中该方法的研究成果，改进饲料中的测定方法，还有待于更进一步的摸索和实践。
