高效液相色谱法测定饲料中磺胺喹恶啉方法研究
磺胺喹恶啉属磺胺类抗生素兼有抗球虫作用，广泛用于养禽业，其口服后吸收迅速，但排泄缓慢，残留在组织器官及鸡蛋中时间长，人食用后，对人体产生耐药性等副作用。世界卫生组织(WHO)规定动物组织、奶的最高残留限量(MRL)值为100μg/kg。日本等国规定肉鸡中不得检出。因此，该药的使用应严格控制用药期及用药量，以保证产品的安全及对外贸易畅通。
据英国兽药典记载，磺胺喹恶啉纯品为黄色粉末，几乎无味，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于碱性溶液。目前，饲料中磺胺喹恶啉的检测方法美国AOAC标准是采用分光光度法，该法要求含阿散酸及不含阿散酸的饲料采用两种不同的测定方法。而国内饲料目前添加组分较复杂，检测者对饲料情况是未知的，难以确定用哪一个方法；且该方法中需要重氮化试剂做偶合反应，其毒性大，对操作者及环境都会造成危害。因此，我们没有采用该法。另外，还有文献报道用气相色谱法测定，中间仍需重氮化衍生。我们最终选用高效液相色谱法。
1.测定方法
1.1原理用甲醇水溶液提取饲料中的磺胺喹恶啉，离心，过滤，在HPLC仪上分离,紫外检测器240nm处测定。
1.2试剂和溶液
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T6682规定的一级水。
1.2.1磺胺喹恶啉标准品：含磺胺喹恶啉(C14H12N4O2S) 95.0％。
1.2.2甲醇：色谱纯。
1.2.3磷酸盐溶液：取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钾5.71g，加水溶解并稀释至1000mL。
1.2.4磺胺喹恶啉标准溶液：准确称取磺胺喹恶啉(4.1)50mg，溶于甲醇并稀释成0.1mg/mL的储备液，置4℃冰箱中避光保存，有效期1个月。临用前，取此储备液用水稀释成适当浓度的标准工作液。
1.2.5提取液：甲醇100mL＋水50mL
1.3仪器
1.3.1实验室常用仪器设备
1.3.2高效液相色谱仪(配紫外检测器)
1.3.3分析天平：感量为0.0001g和0.001g
1.3.4旋涡振荡器
1.3.5离心机：4000r/min
1.3.6针头过滤器：备孔径为0.45μm微孔滤膜
1.4分析步骤
1.4.1提取
称取5g试样，精确至0.001g，加入提取液(4.5)50mL，旋涡振荡器混匀，超声水浴中提取15min，中间取出摇动1次，然后4000r/min离心5min，静置，取上清液过0.45μm滤膜，供液相色谱测定。
1.4.2标准曲线的制备
准确吸取储备液适量，用水或流动相稀释成浓度分别为0.10、0.50、1.00、2.00、10.0μg/mL的磺胺喹恶啉标准溶液，做出标准曲线。
1.4.3测定
1.4.3.1色谱条件
色谱柱：C18柱柱长150mm，柱内径4.6mm，粒度5μm或性能相当者。
流动相：磷酸盐溶液75mL＋甲醇25mL，用前过0.45μm滤膜，并超声脱气。
流速：1mL/min。
检测波长：240nm。
进样量：10～20μL。
1.4.3.2定性与定量
根据标准品的保留时间定性，定量由标准曲线或单点校准。
1.4.4结果的计算
每千克试样中含磺胺喹恶啉的质量按下式公式计算：
m1
x=— ×D
m
x——每千克试样中磺胺喹恶啉的质量(mg)；
m1——色谱峰面积对应的磺胺喹恶啉的质量(μg)；
D——稀释倍数；
m——所称样品的质量(g)。
平行测定结果用算术平均值表示，保留至小数点后1位。
2.结果与讨论
2.1 色谱条件的确定
大多数磺胺类药物常以磷酸/乙腈体系做为流动相，而磺胺喹恶啉在该体系下出峰时间是56min，影响检测效率。改用磷酸盐/甲醇体系做流动相。
通过改变磷酸盐和甲醇的比例，磺胺喹恶啉的保留时间发生了变化。
磷酸盐: 甲醇 磺胺喹恶啉保留时间 (min)
70: 30 4.86
75: 25 7.80
80: 20 12.32
出峰早磺胺喹恶啉与杂质峰相互干扰，出峰晚影响检测效率，峰形变宽。磷酸盐与甲醇比例75:25较为合适。
2.2方法线性与最小检出限
对5.0、10.0、20.0、100.0mg/kg的添加浓度按上述方法测定。
添加浓度(mg/kg)5.0 10.0 20.0 100.0
峰面积35906 71684 122536 771414
线性方程为：y=7821.8～13601.6
相关系数为：r=0.9992
方法最小检出浓度为5.0mg/kg。磺胺喹恶啉的使用剂量鸡配合饲料是60g/t，能够检出低于用量10倍浓度已能满足检测需要。
2.3方法的准确度与精密度
根据磺胺喹恶啉在配合饲料中允许使用量为60mg/kg，取配合饲料分别制成5、60、100mg/kg的磺胺喹恶啉添加试样，每个浓度做5个平行，提取，上机测定，计算回收率及方法变异系数。
添加量实测值 回收率 变异系数
(mg/kg)(mg/kg) (％) (n=5)
54.5 89.4 6.7
6055.6 92.6 2.1
10095.2 95.2 4.6
2.4适用范围
取添加剂预混合饲料及浓缩料制成添加试样，提取，适当稀释上机测定。
添加量实测值 回收率 变异系数
(mg/kg)(mg/kg) (％) (n=5)
添加剂预混合饲料200 190.2 95.1 5.4
添加剂预混合饲料1500 1480.6 98.7 2.1
浓缩料100 91.5 91.5 6.2
总之，通过上述实验考查，说明该方法不仅适用于配合饲料，同样也适用于浓缩及添加剂预混合饲料。
3.结论
通过上述实验考查，本方法提取操作简便、快捷，在此色谱条件下，分辨率高，干扰少，适用于配合饲料、浓缩料及添加剂预混合饲料中磺胺喹恶啉的测定。方法最小检出浓度满足实际监督检测需要，具有较好的准确度及精密度。
