有关饲料多维及预混料添加剂中脂溶性维生素的测定，由于维生素易破坏、易变化、含量低，一直被视为难点。我们在国内外文献的基础上，进一步探讨了试样前处理方法，用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定脂溶性维生素的色谱条件，使测定方法简便适用，分析结果准确可靠。
1 仪器与试剂
仪器：HP1050高效液相色谱仪(含四元梯度泵)、可变波长检测器、自动进样器、恒温水浴箱、化学工作站。
预柱ODSHypersil(5 μm，20×4 mm)；
分析柱ODSHypersil(5 μm，125×4 mm)；
试剂：石油醚、甲醇、95%乙醇、抗坏血酸、氢氧化钾、无水硫酸钠、维生素标样(均为Sigma产品)。除特殊规定外，所用试剂均为分析纯，水为重蒸水或相应纯度的水。
2 试样前处理
称取试样1.00～2.00g，置于烧瓶中，加入0.5 g抗坏血酸、20 mL 95 %乙醇及5 mL氢氧化钾溶液(50 %)，置于80 ℃水浴中皂化30 min，皂化液用石油醚萃取，收集醚层并定容至50 mL，然后用水洗至中性，过无水硫酸钠柱备用。
取上述备用液适量，旋转蒸发器真空抽干，立即用甲醇定容，过滤，装瓶上机。标样同样处理。
色谱条件：维生素A、E测定：流动相甲醇∶水—98∶2；流速：1.2mL/min；维生素A测定波长326 nm，维生素E测定波长292 nm；维生素D3的测定：流动相：甲醇∶水为92∶8；流速：1.2 mL/min；检测波长：265 nm。操作均应避光，流动相即配即用。
3 测定结果
3.1 试样前处理
1)萃取时使用石油醚，萃取效果更佳，且其沸点高于乙醚，在高温的夏季更为适用。
2)萃取过程中，如发生乳化现象时，可加入少量无水乙醇。
3.2 色谱条件
1)波长选择：通过对维生素A、维生素E、维生素D3的紫外扫描，它们最大吸收波长分别为：325nm、292 nm、265 nm。
2)流动相的选择：将甲醇和水的五种不同配比流动相用于检测，发现甲醇∶水=98∶2时，对维生素A、维生素E的分离效果最佳；而加大水的比例，使甲醇∶水=92∶8时，可达到使维生素D3与杂峰分开的效果。
3)维生素A、E、D3的标准液每次需经紫外分光光度计比色或扫描，按一定公式计算其准确含量。4)线性范围：VA：4.5IU/mL～100 IU/mL r=0.9999；VE：1.5 μg/mL～50 μg/mL r=0.999；VD3：50 IU/mL～1500 IU/mL r=0.9999。5)准确度：分两个梯度将维生素标样添加到样品中，按本方法测定，得到回收率如表1。某多维产品测定结果与规格比较见表2。6)重复性：用本方法对同一多维预混料中维生素A、E、D3进行若干重复测定，结果见表3。
表1 回收率
维生素A
维生素E
维生素D3
93.62 %～108.38 %
91.83 %～96.80 %
92.90 %～106.34 %
表2 测定结果与产品规格比较
维生素A
维生素E
维生素D3
标示量(IU/kg)
5.00×107
75
1.00×107
测定值(IU/kg)
4.97×107
72.9
0.98×107
误差(%)
0.60
2.73
2.00
表3 重复性
1
2
3
4
5
6
7
X
S
CV
VA1.00×107(IU/kg)
4.50
4.58
4.41
4.39
4.47
4.44
4.55
4.48
0.075
1.56 %
VE(g/kg)
32.15
31.80
30.72
31.52
31.87
32.00
31.04
31.58
0.48
1.67 %
VD31.00×107(IU/kg)
1.40
1.46
1.33
1.37
1.38
1.38
1.47
1.40
0.050
3.49 %
