本标准参照采用ISO 5983-1979《动物饲料-氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。
1主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。
2引用范围
GB601 化学试剂 滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备
3原理
凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。假如强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
4试剂
4.1硫酸（GB 625）：化学纯，含量为98%，无氮。
4.2混合催化剂：0.4g 硫酸铜，5个结晶水（GB 665），6g硫酸钾（HG 3-920）或硫酸钠（HG 3-908），均为化学纯，磨碎混匀。
4.3氢氧化钠（GB 629）：化学纯，40%水溶液（M/V）。
4.4硼酸（GB 628）：化学纯，2%水溶液（M/V）。
4.5混合指示剂：甲基红（HG 3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3-1220）0.5乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
4.6盐酸标准溶液：邻二甲苯氢钾法标定，按GB 601制备。
4.6.10.1mol/L盐酸（HCl）标准溶液：8.3mL盐酸（GB 622），分析纯，注入1000mL蒸馏水中。
4.6.20.02mol/L盐酸（HCl）标准溶液：1.67mL盐酸（GB 622），分析纯，注入1000mL蒸馏水中。
4.7蔗糖（HG 3-1001）：分析纯。
4.8硫酸铵（GB1396）：分析纯，干燥。
4.9硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置于阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。
5仪器设备
5.1实验室用样品粉碎机或研钵。
5.2分样筛：孔径0.45mm（40目）。
5.3分析天平：感量0.0001g。
5.4消煮炉或电炉。
5.5滴定管：酸式，10、25mL。
5.6凯氏烧瓶：250mL。
5.7凯氏定氮装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸馏式。
5.8锥形瓶：150、250mL。
5.9容量瓶：100mL。
5.10消煮管：250mL。
5.11定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。
6试样的选取和制备。
选取具有代表性的样品用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。
7分析步骤
7.1仲裁法
7.1.1试样的消煮
称取试样0.5~1g（含氮量5~80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶（5.6）中，加入6.4g混合催化剂（5.4），与试样混合均匀，再加入12mL硫酸（4.1）和两粒玻璃珠，将凯氏烧瓶（5.6）置于电炉（5.4）上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360~410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。
7.1.2氨的蒸馏（蒸馏步骤的检验见附录)
7.1.2.1常量蒸馏法
将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入60~100mL蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶（5.6）中加入50mL氢氧化钠溶液（4.3），轻轻摇动凯氏烧瓶（5.6）使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1~2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
7.1.2.2半微量蒸馏法
将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将半微量蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶（5.8）内。蒸汽发生器（5.7）的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此溶液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10~20mL注入蒸馏装置的（5.7）反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠（4.3），小心提起玻璃塞之之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶（5.8）使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
注：7.1.2.1和7.1.2.2蒸馏法测定结果相近可任选一种。
附录：蒸馏步骤的检验
精确称取0.2g硫酸铵（4.8），代替试样，按7.1.2或7.2.2步骤进行操作，测的硫酸铵含氮量为21.19±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
7.1.3滴定
用7.1.2.1或7.1.2.2法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L（4.6.1）或0.02mol/L（4.6.2）盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。
7.2推荐法
7.2.1称取0.5~1g试样（含氮量5~80mg）准确至0.0002g，放入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合催化剂（4.2），12mL硫酸（4.1），于420℃下在消煮炉上消化1h。取出放凉后加入30mL蒸馏水。
7.2.2氨的蒸馏
采用全自动定氮仪（5.11）时，按仪器本身常量程序进行测定。
采用半自动定氮仪（5.11）时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸（4.4）为吸收液，加入2滴混合指示剂（4.5），蒸馏装置的末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液（4.3）进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。
7.2.3滴定
用0.1mol/L的标准盐酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液颜色由蓝绿色变成灰红色为终点。
8空白测定
称取蔗糖0.5g代替试样，按第七章进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液（4.6.1）的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.3mL。
9分析结果的表述
9.1计算见下式：
粗蛋白质（%）=（V2-V1）×C×0.0140×6.25×V×100/m×V:
式中：V2--滴定试样时所需标准盐酸溶液体积，mL；
V1--滴定空白所需标准盐酸溶液体积，mL；
C--盐酸标准溶液浓度，mol/L；
m--试样质量，g；
V--试样分解液总体积，mL；
V:--试样分解液蒸馏用体积，m/L；
0.0140--每毫克当量氮的克数；
6.25--氮换算成蛋白质的平均系数。
9.2重复性
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。
当粗蛋白含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。
当粗蛋白含量在10%~25%之间时，允许相对偏差为2%。
当粗蛋白含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。
