1范围
本标准规定了饲料中盐酸克仑特罗的测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中盐酸克仑特罗的检测。
第一篇高效液相色谱法
2原理
样品经有机溶剂（甲苯+氯甲烷混合液）抽提，提取液经酸性氧化铝小柱纯化，洗脱液浓缩后用0.1mol/L盐酸溶解后供高效液相色谱仪进行检测。
3试剂
除方法另有规定外，试剂均为分析纯，水为二次重蒸水或超纯水。
3.1酸性氧化铝（100-200目），层析用。
3.2甲苯。
3.3二氯甲烷。
3.4乙腈，色谱纯。
3.50.1mol/L盐酸。
3.6氢氧化钠。
3.720mol/L磷酸二氢钾溶液。
3.830μmol/L乙二胺四乙酸二钠溶酸。
3.9盐酸克仑特罗贮备液：精密称取盐酸克仑特罗标准品，用0.1mol/L盐酸溶液配成约100μg/ml标准贮备。
3.10盐酸克仑特罗标准工作液：将贮备液用0.1mol/L盐酸溶液稀释为（0.1-2.0）μg/ml，放在水箱中备用。
4仪器
4.1高效液相色谱仪，配有紫外检测器。
4.2旋转蒸发器。
4.3离心机。
4.4超声波发生器。
5操作方法
5.1提取
称取饲料样品约5g（精确至0.001g），加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，超声波处理15分钟，离心5分钟（400转/分），取上清液用40％NaOH溶液调节至pH12。加甲苯一二氧甲烷（3：1V/V）三次提取（每次20ml），合并提取液。
5.2净化
将提取液蒸发至约5ml，过酸性氧化铝小柱（直径1cm，长12cm），用0.1mol/L盐酸溶液洗脱待测成分，洗脱液水浴蒸干后用0.1mol/L盐酸溶液0.50ml溶解，0.45μm滤膜过滤后供高压液相色谱仪检测。
5.3色谱条件。
5.3.1色谱柱，G18柱。
5.3.2流动相：乙腈：缓冲液[20mmol/L磷酸二氢钾+30μmol/LEDTA，ph3.9]（20：80V/V）
5.3.3流速：1ml/分钟。
5.3.4检测波长：243nm。
5.3.5进样量：20μl。
5.3.6柱温：30℃。
5.4测定
根据样品液中盐酸克仑特罗含量情况，选定峰面积相近的标准工作液。标准工作溶液和样液中盐酸克仑特罗响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品等体积参插进行测定。
5.5计算
W=A×Cs×V÷（As×m）
公式中：W——样品中克仑特罗的含量（μg/g）；
A——样品中克仑特罗的峰面积（μv.s）；
Cs——标准工作液中克仑特罗的浓度（μg/m）；
As——标准工作液中克仑特罗的峰面积（μv.s）；
m——样品量（g）；
V——样液量终体积（ml）。
6精密度和灵敏度
在上述色谱条件下，本方法的检测限为0.01μg/g，回收率为80％±20％。
第二篇酶联免疫吸附法
7原理
利用固相酶联免疫吸原理，将盐酸克仑特罗异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入稀释的尿样（未知抗原）及酶标盐酸克仑特罗抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标盐酸克仑特罗抗原结合的量，即样品中盐酸克仑特罗多，则被抗体结合酶标克仑特罗抗原少，颜色浅，反之则深。用目测法或仪器法与盐酸克仑特罗标样比较来判断样品中盐酸克仑特罗的含量。
8试剂和材料
除方法另有规定外，试剂均为分析纯，水为二次重蒸水或超纯水。
8.1盐酸克仑特罗酶联免疫试剂盒：德国R-Bioparm公司生产或类似产品。
8.21mol/L盐酸。
9仪器与设备
9.1酶标测定仪，含有450nm的滤光片。
9.2微量连续可调移液器及配套吸头：（10-200）μL。
9.3冰箱：4℃-8℃.
9.4离心机：0-10000rpm。
9.5超声波发生器。
10试样制备
10.1均质：称取2.0g粉碎的样品，加入2ml1mol/LHCL溶液，再加入16ml蒸馏水，超声波处理10min，振荡30min均质；
10.2离心：2001rpm离心15min，取上清液，加入2ml1mol/LnaOH混合，确认pH值在6.5-7.5，再次2001rpm离心15min，取上清液；
10.3用双蒸水10倍稀释，取20μl进行分析（浓度高的样品可仍用双蒸水苏梯度稀释）；
10.4对于浓缩饲料和预混合饲料样品，应用RIDAC18柱纯化后进行分析：先后用3ml甲醇洗涤柱子和2ml50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0）洗涤柱子，样品进柱，再用2ml150mm0l/L磷酸二氢钾缓冲（pH3.0）洗涤柱子，正压去除残留流体并用空气吹干柱子，用1ml甲醇洗脱样品，蒸发溶剂）
11测定步骤
11.1试剂盒和待检样品检测前平衡至室温（19℃-25℃）。
11.2每个微孔加入100μl稀释后的抗体溶液，充分混合并在室温孵育15min；
11.3倒出微孔中液体，250μl蒸馏水洗涤3次，拍干，加入20μl标准液或处理好的样品（标准和样品做两个平行实验），再加入100μl稀释的酶标记物，充分混匀，室温孵育30min；
11.4倒出微孔中液体，250μl蒸馏水洗涤3次，拍干，加入50μl基质和50μl发色剂，充分混匀，室温暗处孵育15min；
11.5加入100μl反应终止液，混匀后在酶标仪450mm处读取吸光度值。
12结果计算
12.1计算标准品和样品的平均吸光值。
12.2以标准品浓度的对数为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准工作曲线。
12.3以样品吸光值在标准工作曲线上查出相对浓度，乘以样品稀释倍数。
13灵敏度
本方法的检测限为100mg/kg。
14其他
14.1试剂盒应放在4℃-8℃冰箱内保存。
14.2为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。
